| 腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAMe）是甲硫氨酸的活性形式,1951年为Cantoni所发现,在生物体内 由甲硫氨酸和ATP经SAMe合成酶合成。SAMe是一种重要的生理活性物质,参与了生物体内40多种生化反应, SAMe代谢异常将会导致肝脏疾病和各种精神混乱。正是于SAMe如此复杂地涉及到重要的生化反应,因此表现 出广泛治疗作用,对关节炎、抑郁症和肝脏功能紊乱等均有较好地治疗作用,而且还是预防癌症、心血管疾病和抗衰老的保健药物[1]。正是由于腺苷蛋氨酸广泛的药用价值,引起了国内外众多研究者的兴趣。毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种的真核表达系统,由于其具有强烈的好氧生长偏爱性[2],因此在对重组毕赤酵母高密度发酵表达腺苷蛋氨酸的研究中,本文重点研究了发酵液中溶解氧浓度对重组毕赤酵母表达产物的影响。 1 材料与方法 1·1材料 1·1·1菌株:重组毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌,由本公司保存。 1·1·2培养基:YPD培养基[3]。 1·2方法 1·2·1测定方法:HPLC法测定发酵液中SAMe的含量[3];用溶氧电极（梅特勒-托利多仪器有限公司）测定发酵液中溶氧浓度。 1·2·2培养方法[3]:将保藏菌种接种到YPD平板培养基上,划线培养,置30℃培养箱中培养48h。挑选生长良好的单菌落接种到YPD种子培养基中,在30℃,300rpm摇床中培养16~24h后,按照1%的接种量接入装有10L培养基（10g·L-1酵母膏,10g·L-1蛋白栋,0·05M磷酸钾缓冲液,13·4 g·L-1含有硫氨酸的酵母基本氮源,4×10-4g·L-1生物素,2 g·L-1甘油,20 g·L-1甲醇,7·5 g·L-1L-甲硫氨酸）的发酵罐中进行发酵,控制pH值5·0。发酵约20h,待甘油耗尽后,继续流加甘油培养基（50%,含L-甲硫氨酸10 g·L-1）约10h,当菌湿重达到200 g·L-1后,开始流加甲醇,诱导表达腺苷蛋氨酸。 1·2·3发酵液中溶氧控制方法:通过控制发酵过程中的通气量、搅拌转速、罐压和辅助通入纯氧等方法来控制发酵液中的溶解氧浓度。当发酵液中溶氧值低于目标值时,首先提高通气量来改善发酵液中的溶氧情况;当采用提高通气量不能有效改善发酵液中溶氧情况时,可适当提高搅拌转速来控制;同理,依次采取提高罐压和辅助通入纯氧来控制发酵液中的溶氧浓度。 2 结果与讨论 为了考察发酵液中不同溶氧浓度对重组毕赤酵母表达腺苷蛋氨酸的影响,我们设计了3组试验,*组试验,在整 个发酵过程中不控制发酵液中的溶氧;第二组试验,控制发酵过程中的溶氧在30%左右;第三组,控制发酵过程中的溶氧在50%左右。试验结果见表1。
在重组毕赤酵母高密度发酵过程中,为了获得高生物量和高浓度表达产物,通常投入几倍于生物量的基质以满足菌体迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。由于发酵液中的营养物质极为丰富,使得重组毕赤酵母菌株在接种并度生长延迟期,进入对数生长期后,菌株生长极为迅速,进而需要消耗大量的氧气。因此,发酵液中的溶氧值迅速降低,当不采取任何措施改善溶氧条件时,发酵液中的溶氧浓度迅速降低到0,并一直持续到发酵结束。由于氧供给的严重不足,使得细胞的生长收到了限制,尽管溶氧低时生成的细胞膜中不饱和脂肪的含量高,流动性大,易于吸收甲硫氨酸,但是由于细胞的生长受到限制,不能大量供给ATP,因此zui终影响了产物的高浓度表达,使得zui终SAMe的产量很低,仅仅0·5 g·L-1;此时氧供给便成了细胞生长和产物表达的限制因素。 |
